通過活體胚胎電穿孔進行CRISPR介導小腦顆粒細胞功能喪失研究

腦畸形是指在懷孕期間大腦沒有完全形成，并與一些神經和發育問題有關。這種畸形通常是由基因突變引起的，破譯參與正常大腦發育的關鍵基因有助于識別導致大腦疾病和腫瘤形成的潛在因素。為了幫助識別小腦的體細胞突變，研究人員利用基因工程小鼠模型，結合電穿孔的基因傳遞和CRISPR/Cas9技術，開發了一種新的方法來研究一些基因在小腦發育過程中的作用。簡單地說，通過**活體電穿孔，將攜帶向導RNA(sgRNA)和Cre的單個質粒導入Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP(條件性敲入)小鼠的小腦干細胞/前體細胞中。這種方法能夠成功地標記顆粒神經元前體細胞，并允許跟蹤其子代(子細胞)在產后大腦發育過程。

                              外顆粒細胞層中表達gfp的細胞可以觀察到以ki67標記的增殖，將表達對照sgRNA的

                               質粒pU6-sgRNA-Cbh-Cre 通過活體電穿孔導入到E13.5的Rosa26-CAG-LSLCas9-P2A-EGFP

                              小鼠胚胎中，對P7小腦進行GFP,Ki67和p27的免疫染色。DAPI(藍色)對切片進行復染。

ECM 830 & GEMINI 活體胚胎電穿孔Protocol

細胞: CRISPR – sgRNA 質粒導入小腦顆粒細胞，

應用: E13. 5小鼠活體胚胎電穿孔

電極：5 mm 直徑鉑金鑷子電極 # 45-0489

準備向導RNA (sgRNA) 和cre重組酶質粒，終濃度至少1ug/ul，準備fast green染料（終濃度0.05%）。將fast green染料溶于蒸餾水制成1%濃度染料，通過0.22μm濾膜去除染料顆粒。準備一個拉針儀(內徑:0.6 - -0.8毫米)制作玻璃毛細管微量吸液管，每個小鼠（~12胚胎）注射~15ul質粒染料混合液，并立即進行手術。異氟烷麻醉孕13天的孕鼠，暴露**，穿透背部后腦將大約1μl fast green混合的質粒注射到第四腦室中，使用鉑金鑷子施加方波脈沖。

方波電穿孔設置:

電壓: 32 V

脈沖時間: 50 ms

脈沖個數: 5

脈沖間隔時間: 950 ms

電穿孔步驟:

樣本體積 : ~15 ul質粒和fast green混合液/小鼠 (~ 12 胚胎)

電極: 將電極橫向放置，負極覆蓋耳朵，正極置于**壁上方小腦原基

電脈沖 : 點擊Go 或 Start 按鍵，啟動自動充電和脈沖序列

電擊后處理 : 刺激結束后迅速將**移回母鼠腹腔，縫合 腹膜和皮膚，進行麻醉復蘇，細心飼養。

參考文獻:

Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H. K.,Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).